TINCIÓN DE WIRTZ-CONKLIN

1. Objetivo.

Observación de endosporas bacterianas al microscopio.

2. Fundamento.

Queremos observar al microscopio endosporas bacterianas, para ello utilizaremos una tinción por calor para favorecer la penetración de los colorantes.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Mechero.
- Portas.
- Vaso de precipitado.
- Torunda.
- Rejilla.
- Microscopio.
- Agua destilada.

5. Reactivos y muestra.

- Muestras ESP1 y ESP2.
- Verde malaquita al 5%.
- Alcohol.
- Safranina al 0,5%.

6. Protocolo.

1. Preparamos la extensión fijada con calor.
2. Colocamos el porta en una rejilla y cubrimos con verde malaquita al 5%.
3. Calentamos el porta con una torunda con alcohol durante 5 minutos.
4. Dejamos enfriar y lavamos con agua destilada.
5. Cubrimos la extensión con safranina al 0,5% durante 2 minutos.
6. Lavamos con agua destilada y secamos.
7. Observamos al microscopio.

7. Resultados.

• Muestra ESP1:

En nuestra muestra ESP1 podemos observar esporas.

• Muestra ESP2:

En nuestra muestra ESP2 se observan bacilos y esporas.

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

1. Objetivo.

Tinción de bacterias ácido-alcohol resistentes para su observación al microscopio.

2. Fundamento.

Esta tinción permite distinguir un grupo de bacterias cuya pared es resistente a la decoloración por una mezcla de ácido y alcohol, son llamadas bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR).

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.

4. Material.

- Porta objetos.
- Torunda.
- Mechero.
- Asa de siembra.
- Rejilla.
- Agua destilada.
- Vaso de precipitado.
- Microscopio.

5. Reactivos y muestra.

- Muestra AAR 1 y 2.
- Fucsina fenicada.
- Alcohol.
- Alcohol - clorhídrico al 3-5%
- Azul de metileno.

6. Protocolo.

1. Preparamos la extensión fijada con calor.
2. Colocamos el porta en la rejilla y cubrimos con fucsina fenicada.
3. Calentamos el porta con una torunda con alcohol 5 minutos. Dejadlo enfriar.
4. Lavamos el porta con agua destilada.
5. Añadimos alcohol - clorhídrico al 3-5% y dejamos 2 minutos.
6. Lavamos con agua destilada y escurrimos.
7. Cubrimos con azul de metileno durante 2 minutos.
8. Lavamos con agua destilada y secamos.
9. Observamos al microscopio.

7. Resultados.

• Muestra AAR1:

En la muestra AAR1 observamos cocos.

• Muestra AAR2:

En la muestra AAR2 observamos bacilos y esporas.

SIEMBRA EN PLACA Y TUBO INCLINADO

1. Objetivo.

Sembrar en placa mediante método normal y asa estéril; y en tubo inclinado.

2. Material.

- Placa de petri.

- Asa de siembra.

- Asa de siembra estéril.

- Tubo inclinado.

3. Medidas de seguridad.

- Mechero.

- Guantes.

- Bata.

4. Protocolo.

• Siembra en placa por aislamiento.

1. Encendemos el mechero y esterilizamos el asa de siembra.
2. Abrimos el tubo que contiene la muestra y esterilizamos la boca.
3. Tomamos la muestra con el asa y esterilizamos la boca del tubo para ponerle el tapón.
4. Abrimos la placa debajo del mechero y comenzamos a sembrar en un lado.
5. Esterilizamos el asa y enfriamos en un lado de la placa que no contenga muestra. Tomamos muestra de la siembra anterior y hacemos otra extensión en la placa.
6. Volvemos a esterilizar el asa y enfriamos en un lateral que no contenga muestra.
7. Seguimos la extensión con una esquina de la anterior. Esterilizamos el asa.
8. Repetimos el proceso hasta sembrar la placa completa.

• Siembra en placa con asa estéril.

1. Encendemos el mechero y abrimos el tubo que contiene la muestra.
2. Esterilizamos la boca del tubo y con el asa estéril tomamos una muestra.
3. Volvemos a esterilizar la boca del tubo y cerramos.
4. Abrimos la placa y comenzamos la siembra.
5. Sin esterilizar el asa, continuamos con la siembra hasta completar la placa.

• Siembra en tubo inclinado.

1. Encendemos el mechero y esterilizamos el asa.
2. Abrimos el tubo que contiene la muestra y esterilizamos la boca.
3. Cargamos el asa. Volvemos a esterilizar la boca del tubo y cerramos.
4. Abrimos el tubo en el que vamos a sembrar y esterilizamos la boca.
5. Metemos el asa en el fondo del tubo y comenzamos a hacer estrías hacia arriba.
6. Esterilizamos la boca del tubo y tapamos. Esterilizamos el asa.

TINCIÓN DE GRAM

1. Objetivo.

Diferenciación de bacterias grampositivas y gramnegativas al microscopio.

2. Fundamento.

La tinción de Gram es una tinción diferencial que permite saber la morfología, tamaño y agrupamiento de las bacterias, además de dividir a las bacterias en dos grupos, grampositivas y gramnegativas, según el color del que se tiñen.


3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.

4. Material.

- Portaobjetos.
- Microscopio.
- Pipetas pasteur.
- Asa de siembra.
- Mechero.
- Agua del grifo.
- Suero fisiológico.

5. Muestra y reactivos.

- Muestras 5 y 8.
- Cristal violeta.
- Lugol.
- Mezcla de 70% Alcohol- 30% cetona.
- Safranina.

6. Protocolo.

1. Ponemos una gota de suero fisiológico en un portaobjetos.
2. Esterilizamos el asa de siembra en el mechero y cogemos una muestra de nuestros tubos y realizamos una extensión junto con el suero fisiológico.
3. Fijamos con calor.
4. Cubrimos la extensión con cristal violeta y incubamos 1 minuto.
5. Decantamos y lavamos con agua del grifo.
6. Cubrimos la extensión con lugol y incubamos 1 minuto.
7. Decantamos y lavamos con agua del grifo.
8. Cubrimos la extensión con la mezcla de alcohol-cetona y incubamos 30 segundos.
9. Decantamos y lavamos con agua de grifo.
10. Cubrimos la extensión con safranina y incubamos 2 minutos.
11. Decantamos y lavamos con agua del grifo.
12. Secamos a Tª ambiente o con un secador y observamos al microscopio.

7. Resultados.

• Muestra 5:

En nuestra muestra nº 5 podemos observar bacilos grampositivos.

• Muestra 8:

En nuestra muestra nº 8 podemos observar bacilos gramnegativos.

TINCIÓN SIMPLE CON AZUL DE METILENO

1. Objetivo.

Observación de bacterias.

2. Fundamento.

En una tinción simple se utiliza un único colorante, de manera que todas las bacterias presentes se tiñen igual. Sirve para estudiar la morfología individual, el tamaño y los agrupamientos de las bacterias. La tinción con azul de metileno es una tinción simple positiva, rápida y sencilla.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.

4. Materiales.

- Microscopio.

- Portaobjetos.

- Mechero.

- Asa de siembra.

5. Muestra y reactivos.

- Azul de metileno al 1%.

- Actimel.

6. Protocolo.

1. Encendemos el mechero, esterilizamos el asa de siembra y cogemos una muestra del bote de actimel. Realizamos una extensión.
2. Fijamos la extensión con calor.
3. Cubrimos la extensión fijada con una solución de azul de metileno al 1% y incubamos 2 minutos a Tª ambiente.
4. Lavamos con agua destilada con mucho cuidado y dejamos secar.

7. Resultados.

En nuestra preparación se pueden observar bacterias, en concreto diplococos.

OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO DE AGUA DE CHARCO Y RÍO SEGURA

1. Objetivo.

Observación de distintas muestras al microscopio.

2. Fundamento.

Tomaremos una muestra de agua del río Segura y una muestra de agua de un charco para observar al microscopio.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.

4. Material.

- Portaobjetos cóncavos.
- Cubres.
- Microscopio.

5. Resultado.

• Observación de agua de río Segura:

• Observación agua de charco:

TINCIÓN VITAL

1. Objetivo.

Técnica que permite observar microorganismos vivos con la ayuda de colorantes.

2. Fundamento.

Una tinción vital se realiza sobre células vivas. Para ello necesitaremos un colorante vital muy diluido, en nuestro caso fucsina a 1/10000. El colorante se introduce en la célula cuando aún se encuentra viva.


3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.
- Mezcla de alcohol para poner los portas ya observados.

4. Material

- Portaobjetos esmerilados.
- Agua destilada.
- Asa de siembra.
- Matraz aforado.
- Cubres.
- Mechero.
- Embudo.
- Vaso de precipitado.

5. Muestras y reactivos.

- Fucsina a 1/10000
- Muestras de cultivo nº5 y nº8.
- Suero fisiológico.

6. Protocolo.

1. Se prepara una disolución de fucsina en agua destilada a 1/10000.
2. Se pone una gota de la disolución de fucsina en un portaobjetos.
3. Con un asa de siembra se coge una muestra de un cultivo y se mezcla con la gota de fucsina, puesta en el portaobjetos, realizando una extensión.
4. Se fija la muestra con calor y se observa al microscopio.

7. Cálculos.

Para sacar la cantidad de fucsina utilizada:

1 ----- 10000              x = 0.01 → 10 microlitros.
x ----- 100           

8. Resultado.

En nuestra muestra podemos observar bacterias (círculos pequeños).

USO DE AUTOCLAVE

Lo primero que tenemos que comprobar es que el autoclave contenga agua destilada hasta cubrir la resistencia. Seguidamente debemos comprobar que la válvula del agua se encuentre cerrada y que la válvula de vapor se encuentre abierta.
La válvula de vapor debe permanecer abierta hasta que la temperatura alcance los 100ºC, a partir de ese momento habrá que cerrarla.

En nuestro caso, utilizaremos el programa 3 de la autoclave, donde la temperatura es de 121ºC y el tiempo de 20 minutos.

Una vez haya terminado, debemos esperar a que la temperatura disminuya hasta los 100ºC, en ese momento debemos abrir la válvula de vapor poco a poco.

PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO

1. Objetivo.

Prepararemos medios de cultivo en placa, medios de cultivo líquidos y medios de cultivo en tubo. Para ello realizaremos una mezcla homogénea de agar y agua destilada, normalmente el fabricante del agar nos indicará en el envase la cantidad de agua que se debe añadir.

2. Fundamento.

Realizaremos una mezcla de agar y agua destilada para preparar medios de cultivo en placa y en tubos. Para medios de cultivo líquidos realizaremos una mezcla de 250ml de agua destilada y caldo nutritivo.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.
- Campana de bioseguridad.

4. Material y reactivos.

• Para medios de cultivo líquidos:

- 30 tubos de 10ml.

- Frasco lavador.

- Tapones para tubos de ensayo.

- Pipeta de 10ml.

- Cremallera.

- Frasco de vidrio.
- Pipeta pasteur.

- Embudo.

- Autoclave.

- Vidrio de reloj.

- Probeta de 250ml.

- Papel albal.

- Caldo nutritivo.

• Para medios de cultivo en placa de petri:

- 15 placas de petri.

- Frasco lavador.

- Frasco de vidrio.

- Embudo.

- Autoclave.

- Vidrio de reloj.

- Probeta de 250ml.
- Pipeta pasteur.

- Agar nutritivo.

• Para medios de cultivo en tubo:

- 50 tubos de 10ml.

- Frasco lavador.

- Tapones para tubos de ensayo.

- Pipeta de 10ml.

- Cremallera.

- Frasco de vidrio.

- Embudo.
- Pipeta pasteur.

- Autoclave.

- Vidrio de reloj.

- Probeta de 250ml.

- Papel albal.

- Agar nutritivo.

5. Protocolo.

• Para medios de cultivo líquidos:

1. Pesamos la cantidad de caldo nutritivo indicada por el fabricante para 250ml de agua destilada, previamente medida en una probeta.
2. Añadimos un poco de agua destilada en un frasco de rosca y los 2g de caldo nutritivo. Añadimos el resto de agua destilada y homogeneizamos hasta que no queden restos de polvos de caldo.
3. Calentamos en el microondas sin que llegue a hervir o podría salirse del frasco la mezcla.
4. Con una pipeta de cristal de 10ml, añadimos en cada tubo de ensayo 7ml de nuestra mezcla homogénea de caldo y agua destilada.
5. Ponemos un tapón en cada tubo y rotulamos con la fecha y el contenido.
6. Colocamos los tubos en una gradilla y los llevamos a la autoclave.
7. Por último llevamos al frigorífico y conservamos.

• Para medios de cultivo en placa:

1. Pesamos la cantidad de agar nutritivo indicada por el fabricante para nuestra cantidad de agua destilada. En este caso mezclaremos 6,9g de agar nutritivo en 300ml.
2. Medimos en una probeta los 300ml de agua destilada.
3. Añadimos en un frasco de cristal un poco de agua destilada y los 6,9g de agar nutritivo. Echamos el agua destilada restante.
4. Llevamos al microondas y calentamos sin que llegue a hervir.
5. Ponemos el tapón del frasco de cristal sin cerrar del todo, solo con una vuelta. Llevamos a la autoclave.
6. Por último dejamos que se enfríe un poco el frasco y comenzamos a echar en las placas de petri. Hay dos formas de hacerlo:

               - Vertiendo la mezcla en las placas dentro de la campana de extracción                                     para evitar que se forme vapor.

               - Esperar a que se enfríe la mezcla y con el mechero encendido, para                                     crear un ambiente estéril, rellenar las placas una a una.

• Para medios de cultivo en tubo:

1. Pesamos 6,9g de agar nutritivo y medimos en un probeta 300ml de agua destilada.
2. Mezclamos en un frasco de cristal un poco de agua destilada y los 6,9g de agar nutritivo. Añadimos el agua restante.
3. Llevamos al microondas y calentamos sin que llegue a hervir.
4. Ponemos el tapón al frasco de cristal sólo con una vuelta, sin cerrar del todo.
5. Llevamos a la autoclave.
6. Dejamos enfriar un poco el frasco de cristal.
7. Una vez enfriado, con una pipeta de cristal de 10ml, añadimos 7ml a cada tubo y ponemos tapones. Todo esto se realiza con el mechero encendido para crear un ambiente estéril.
8. Con ayuda de una gradilla inclinamos los tubos y esperamos a que solidifiquen. Conservamos en el frigorífico.

6. Cálculos:

Medio de cultivo líquido:                    Medio de cultivo en placa y en tubo inclinado:

8g ------- 1000ml                                            23g -------- 1000ml
xg ------- 250ml                                               x g -------- 300 ml

x = 2g de caldo nutritivo                                    x = 6,9g de agar nutritivo