PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO

1. Objetivo.

Prepararemos medios de cultivo en placa, medios de cultivo líquidos y medios de cultivo en tubo. Para ello realizaremos una mezcla homogénea de agar y agua destilada, normalmente el fabricante del agar nos indicará en el envase la cantidad de agua que se debe añadir.

2. Fundamento.

Realizaremos una mezcla de agar y agua destilada para preparar medios de cultivo en placa y en tubos. Para medios de cultivo líquidos realizaremos una mezcla de 250ml de agua destilada y caldo nutritivo.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.
- Campana de bioseguridad.

4. Material y reactivos.

• Para medios de cultivo líquidos:

- 30 tubos de 10ml.

- Frasco lavador.

- Tapones para tubos de ensayo.

- Pipeta de 10ml.

- Cremallera.

- Frasco de vidrio.
- Pipeta pasteur.

- Embudo.

- Autoclave.

- Vidrio de reloj.

- Probeta de 250ml.

- Papel albal.

- Caldo nutritivo.

• Para medios de cultivo en placa de petri:

- 15 placas de petri.

- Frasco lavador.

- Frasco de vidrio.

- Embudo.

- Autoclave.

- Vidrio de reloj.

- Probeta de 250ml.
- Pipeta pasteur.

- Agar nutritivo.

• Para medios de cultivo en tubo:

- 50 tubos de 10ml.

- Frasco lavador.

- Tapones para tubos de ensayo.

- Pipeta de 10ml.

- Cremallera.

- Frasco de vidrio.

- Embudo.
- Pipeta pasteur.

- Autoclave.

- Vidrio de reloj.

- Probeta de 250ml.

- Papel albal.

- Agar nutritivo.

5. Protocolo.

• Para medios de cultivo líquidos:

1. Pesamos la cantidad de caldo nutritivo indicada por el fabricante para 250ml de agua destilada, previamente medida en una probeta.
2. Añadimos un poco de agua destilada en un frasco de rosca y los 2g de caldo nutritivo. Añadimos el resto de agua destilada y homogeneizamos hasta que no queden restos de polvos de caldo.
3. Calentamos en el microondas sin que llegue a hervir o podría salirse del frasco la mezcla.
4. Con una pipeta de cristal de 10ml, añadimos en cada tubo de ensayo 7ml de nuestra mezcla homogénea de caldo y agua destilada.
5. Ponemos un tapón en cada tubo y rotulamos con la fecha y el contenido.
6. Colocamos los tubos en una gradilla y los llevamos a la autoclave.
7. Por último llevamos al frigorífico y conservamos.

• Para medios de cultivo en placa:

1. Pesamos la cantidad de agar nutritivo indicada por el fabricante para nuestra cantidad de agua destilada. En este caso mezclaremos 6,9g de agar nutritivo en 300ml.
2. Medimos en una probeta los 300ml de agua destilada.
3. Añadimos en un frasco de cristal un poco de agua destilada y los 6,9g de agar nutritivo. Echamos el agua destilada restante.
4. Llevamos al microondas y calentamos sin que llegue a hervir.
5. Ponemos el tapón del frasco de cristal sin cerrar del todo, solo con una vuelta. Llevamos a la autoclave.
6. Por último dejamos que se enfríe un poco el frasco y comenzamos a echar en las placas de petri. Hay dos formas de hacerlo:

               - Vertiendo la mezcla en las placas dentro de la campana de extracción                                     para evitar que se forme vapor.

               - Esperar a que se enfríe la mezcla y con el mechero encendido, para                                     crear un ambiente estéril, rellenar las placas una a una.

• Para medios de cultivo en tubo:

1. Pesamos 6,9g de agar nutritivo y medimos en un probeta 300ml de agua destilada.
2. Mezclamos en un frasco de cristal un poco de agua destilada y los 6,9g de agar nutritivo. Añadimos el agua restante.
3. Llevamos al microondas y calentamos sin que llegue a hervir.
4. Ponemos el tapón al frasco de cristal sólo con una vuelta, sin cerrar del todo.
5. Llevamos a la autoclave.
6. Dejamos enfriar un poco el frasco de cristal.
7. Una vez enfriado, con una pipeta de cristal de 10ml, añadimos 7ml a cada tubo y ponemos tapones. Todo esto se realiza con el mechero encendido para crear un ambiente estéril.
8. Con ayuda de una gradilla inclinamos los tubos y esperamos a que solidifiquen. Conservamos en el frigorífico.

6. Cálculos:

Medio de cultivo líquido:                    Medio de cultivo en placa y en tubo inclinado:

8g ------- 1000ml                                            23g -------- 1000ml
xg ------- 250ml                                               x g -------- 300 ml

x = 2g de caldo nutritivo                                    x = 6,9g de agar nutritivo