PRUEBA KIA

1. Objetivo.

Queremos saber si la bacteria consume azúcares (lactosa y glucosa), su producción de gas y su producción de ácido sulfhídrico, y si se trata de una enterobacteria.

2. Fundamento.

Esta prueba combinada se usa para la diferenciación de enterobacterias y para determinar diversos parámetros como la capacidad de la bacteria de metabolizar glucosa y lactosa, su producción de gas y su producción de ácido sulfhídrico. Para ello el medio que utilizamos contiene glucosa y lactosa como carbohidratos, rojo fenol para determinar el pH y tiosulfato de sodio para la producción de ác. sulfhídrico.

3. Medidas de seguridad.

- Mechero.
- Bata.
- Guantes.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Mechero.
- Agar KIA.

5. Reactivos y muestra.

- Muestras 5 y 8.

6. Protocolo.

1. Cogemos con el asa una muestra y sembramos en el medio de cultivo por picadura. Para ello picamos en el fondo y extendemos sobre la superficie del medio.
2. Incubamos en la estufa durante 24h y observamos el resultado. 

       - Si se observa el pico del medio rojo y en el fondo amarillo significa que fermenta glucosa.
       - Si el medio está completamente amarillo, significa que fermenta glucosa y lactosa.
       - Si el medio está completamente rojo, la bacteria no fermenta azúcares.
       - Si se observan burbujas o ruptura del medio, significa que la bacteria produce gas.
       - Se se produce un ennegrecimiento del medio, la bacteria produce ácido sulfhídrico.

7. Resultado.

• Muestra 5:

- El medio se encuentra completamente rojo, por lo que la bacteria no es fermentadora de azúcares.
- No se observa ennegrecimiento, por lo que no produce ácido sulfhídrico.
- No hay burbujas ni rotura del medio, por lo que la bacteria no produce gas.

• Muestra 8:

- El medio se encuentra completamente rojo, por lo que la bacteria no es fermentadora de azúcares.

- Se ha producido un ennegrecimiento del medio por lo que la bacteria produce ácido sulfhídrico.

- En el fondo del medio se puede apreciar una burbuja, por lo que la bacteria produce gas.

PRUEBA DE LA COAGULASA

1. Objetivo.

Realizaremos esta prueba para determinar si la bacteria contiene la enzima coagulasa.

2. Fundamento.

La coagulasa es una enzima que convierte el fibrinógeno en fibrina, por tanto, si la bacteria es capaz de coagular el plasma, significa que contiene la enzima coagulasa. Esta prueba se utiliza para diferenciar entre Staphylococcus aureus de otras especies.

3. Medidas de seguridad.

- Bata.
- Mechero.
- Guantes.

4. Material.

- Tubos de hemólisis.
- Pipetas pasteur.
- Baño maría.
- Mechero.
- Asa de siembra.

5. Reactivos y muestra.

- Plasma.
- Muestras 5 y 8.

6. Protocolo.

1. En un tubo de hemólisis añadimos 500 μl de plasma.
2. Tomamos una muestra con el asa de siembra y la mezclamos con el plasma.
3. Mezclamos por rotación el tubo y lo llevamos al baño maría durante 30 min a 37ºC.
4. Si pasado ese tiempo se forma coágulo, significa que el resultado es positivo y por tanto nuestra bacteria es Staphylococcus aureus. Si por el contrario no se forma coágulo, la prueba es negativa y nuestra bacteria se trata de otro tipo de Staphylococcus.

7. Resultado.

• Muestra 5: no se forma coágulo. El resultado es negativo, por lo que no se trata de Staphylococcus aureus.
• Muestra 8: se forma coágulo. El resultado es positivo, por lo que la bacteria es Staphylococcus aureus.

PRUEBA DE LA OXIDASA

1. Objetivo.

Buscamos en la bacteria la enzima citocromooxidasa que en presencia de oxígeno oxida la fenilendiamina y forma indofenol.

2. Fundamento.

La prueba consiste en poner en contacto la muestra con una tira reactiva que contiene fenildiamina para saber si sintetiza oxidasa.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Mechero.
- Bata.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Mechero.

5. Reactivos y muestra.

- Tiras reactivas.
- Muestras 5 y 8.

6. Protocolo.

1. Tomamos una muestra con el asa de siembra.
2. Frotamos, con el asa, contra la zona reactiva de la tira.
3. Esperar 10 - 30 segundos y observar el resultado. Si la zona ha obtenido un color azulado, la bacteria es positiva en oxidasa. Si no se ha producido cambio de color, la bacteria es negativa en oxidasa.

7. Resultado.

En nuestro caso, ambas muestras fueron negativas en oxidasa.

PRUEBA DE LA CATALASA

1. Objetivo.

El objetivo de esta práctica es saber si la bacteria contiene la enzima catalasa y por tanto puede hidrolizar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso.

2. Fundamento.

Para saber si la bacteria contiene la enzima catalasa y por tanto puede hidrolizar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso, se pone en contacto el peróxido de hidrógeno con la muestra. Esta prueba se puede realizar en tubo o en porta.

3. Medidas de seguridad.

- Bata.
- Guantes.
- Mechero.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Mechero.
- Tubo de ensayo.

5. Reactivos y muestra.

- Peróxido de hidrógeno al 3%.
- Muestras 5 y 8.

6. Protocolo.

1. Se añade una cantidad indeterminada de peróxido de hidrógeno al 3% en un tubo de ensayo.
2. Se toma una muestra con el asa de siembre y se sumerge en el peróxido de hidrógeno.
3. Esperar 15 - 20 segundos y leer el resultado. Si se forman burbujas en el tubo, la prueba es positiva en catalasa. Si no se forman burbujas, la prueba e negativa en catalasa.

7. Resultado.

En nuestro caso ambas muestras fueron negativas en catalasa y por tanto no hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso.

PRUEBA DE IMVIC: PRUEBA INDOL

1. Objetivo.

En esta técnica se busca saber si la bacteria es capaz de degradar triptófano, donde se libera indol.

2. Fundamento.

Para saber si la bacteria es capaz de degradar triptófano, se usa un reactivo llamado Kovac que reacciona con el indol liberado en la degradación, formando un compuesto de color rosa intenso.

3. Medidas de seguridad.

- Bata.
- Guantes.
- Mechero.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Mechero.
- Pipeta pasteur.
- Medio de agua peptonada.

5. Reactivos y muestra.

- Reactivo de Kovac.
- Muestras 5 y 8.

6. Protocolo.

1. Con el asa de siembra cogemos una muestra y la dispensamos en el caldo de cultivo de agua peptonada.
2. Incubamos en la estufa 24 - 48h.
3. Pasado el tiempo se añaden 5 gotas del reactivo de Kovac.
4. Si al añadir el reactivo se forma una banda en la superficie de color rosa intenso o rojo, la prueba es positiva y por tanto la bacteria puede degradar triptófano. Si por el contrario se forma una banda amarilla, la prueba es negativa y la bacteria no puede degradar triptófano.

7. Resultado.

En nuestro caso ambas bacterias son negativas en indol, por lo que no pueden degradar triptófano.

PRUEBA DE IMVIC: ROJO METILO

1. Objetivo.

Esta técnica se emplea para saber la capacidad de una bacteria para fermentar glucosa por vía
ácido-mixta.

2. Fundamento.

Para detectar si la bacteria consume glucosa por vía ácido-mixta, se utiliza un indicador de pH, el rojo metilo, que actúa a pH de entre 4,2 (muestra positiva) y 6,3 (muestra negativa). Sabemos que la muestra es positiva o negativa según el color que adquiera el medio.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Mechero.
- Medio Clark - Lubs.

5. Reactivos y muestra.

- Muestras 5 y 8.
- Rojo metilo.

6. Protocolo.

1. Cogemos muestra con el asa y depositamos en el medio líquido Clark - Lubs.
2. Incubamos durante 24 - 48h.
3. Pasado ese tiempo, añadimos 5 gotas de rojo metilo y observamos el resultado.
4. Si el medio ha tomado un color rojizo significa que la prueba es positiva y que por tanto la bacteria fermenta la glucosa por vía ácido-mixta. Si el medio se queda de color amarillento, significa que la prueba es negativa y que la bacteria no fermenta glucosa por vía ácido-mixta.

7. Resultado.

En nuestro caso, ambas muestras son negativas a rojo metilo. Esto significa que nuestras bacterias no fermentan glucosa por vía ácido-mixta.

PRUEBA DE IMVIC: VOGES - PROSKAUER

1. Objetivo.

Detecta la capacidad de una bacteria para fermentar glucosa por vía butanodiólica. 

2. Fundamento.

Mediante la mezcla de dos reactivos reactivos, α-naftol y KOH, se detecta la presencia de un precursor del butanodiol, la acetoína, que en presencia de oxígeno origina una coloración roja.

3. Medidas de seguridad.

- Bata.
- Guantes.
- Mechero.

4. Material.

- Mechero.
- Asa de siembra.
- Medio Clark- Lubs.

5. Reactivos y muestra.

- Reactivo KOH (VPA).
- Reactivo α-naftol (VPB).
- Muestra 5 y 8.

6. Protocolo.

1. Cogemos con el asa la muestra y sembramos en el medio líquido de Clark - Lubs.
2. Incubamos en la estufa durante 24 - 48h.
3. Pasado el tiempo añadimos en el medio 3 gotas de KOH y después 3 gotas de α-naftol.
4. Homogeneizamos sin volcar ni agitar y esperamos 5 -10 minutos.
5. Si el medio toma un color rosado, la prueba es positiva en acetoína y por tanto la bacteria fermenta la glucosa por vía butanodiólica. Si por el contrario, el medio no toma ningún color y se mantiene amarillo, la prueba es negativa en acetoína y nos indica que la bacteria no fermenta glucosa por vía butanodiólica

7. Resultado.

En nuestro caso, ambas muestras (5 y 8) fueron negativas en acetoína.

PRUEBA DE IMVIC: CITRATO

1. Objetivo.

En esta prueba se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato.

2. Fundamento.

Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo. Se utiliza agar citrato de Simons, que contiene citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH.

3. Medidas de seguridad.

- Bata.
- Guantes.
- Mechero.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Tubo de ensayo con medio de citrato de Simons.
- Mechero.

5. Reactivos y muestra.

- Muestra 5 y 8.

6. Protocolo.

1. Cogemos con el asa la muestra y la sembramos en el tubo de citrato por agotamiento.
2. Incubamos en la estufa 24h.
3. Pasadas las 24h observamos el resultado.

7. Resultado.

Si el citrato ha tomado un color azul intenso significa que la prueba es positiva y por tanto nuestra bacteria ha alcalinizado el medio y utiliza citrato de sodio para su metabolismo.

Si el citrato no presenta ningún cambio de color y continúa verde, la prueba es negativa y por tanto la bacteria no utiliza citrato de sodio para su metabolismo y no ha alcalinizado el medio.

PRUEBA DE LA POTASA

1. Objetivo.

Saber si la bacteria es Grampositiva o Gramnegativa.

2. Fundamento.

Con esta técnica vamos a determinar si la bacteria es Grampositva o Gramnegativa según la viscosidad que presente al mezclarla con KOH al 3%.

3. Medidas de seguridad.

- Bata.
- Guantes.
- Mechero.

4. Material.

- Asa de siembra.
- Mechero.
- Tubo de ensayo.
- Vidrio de reloj.
- Báscula.
- Matraz de 100 ml.
- Embudo.
- Mortero.
- Pipeta pasteur.
- Portaobjetos.
- Agua destilada.

5. Reactivos y muestra.

- Hidróxido de potasio al 3% (KOH).
- Muestras 8 y 5.

6. Cálculos.

• Gramos de KOH necesarios:

     x = (100 x 3) / 90 = 3,33 gr de KOH

    100 - 3,33 = 96,67 ml  de agua destilada

7. Protocolo.

1. Pesamos las lentejas de KOH. Pesamos más gramos de los necesarios.
2. Machacamos con el mortero las lentejas de KOH y volvemos a pesar. Esta vez pesamos los gramos exactos.
3. Añadimos al matraz con agua destilada y terminados de enrasar con ésta.
4. Ponemos un poco de disolución de KOH en un tubo de ensayo.
5. Con una pipeta pasteur, cogemos una gota de KOH y la ponemos en un porta.
6. Con el asa, cogemos la muestra y mezclamos en el porta con la gota de KOH.
7. Si al levantar el asa se crea un hilo, la bacteria es Gramnegativa. Si por el contrario, no se crea hilo, la bacteria es Grampositiva.

8. Resultado.

• Muestra 5:

No se produce el fenómeno del hilo, por tanto nuestra bacteria es Grampositiva.

• Muestra 8:

En este caso si se produjo el fenómeno del hilo, por tanto nuestra bacteria es Gramnegativa.

ANTIBIOGRAMA

1. Objetivo.

Determinar si la bacteria es resistente o sensible a antibióticos.

2. Fundamento.

Un antibiograma permite determinar la sensibilidad o resistencia de una cepa bacteriana frente a un grupo de antibióticos.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Mechero.

4. Material.

- Placa de petri.
- Discos de antibiótico.
- Asa de siembra.
- Tubos de ensayo.
- Micropipeta.
- Pinzas.
- Vaso de precipitado.
- Mechero.
- Asa de digalsky.
- Cartulina negra.

5. Reactivos y muestra.

- Etanol.
- Suero fisiológico.
- Muestras 5 y 8.
- Patrón 0,5 escala de McFarland.

6. Protocolo.

1. Echamos en un tubo suero fisiológico.
2. Cogemos una muestra con el asa y depositamos en el suero fisiológico hasta conseguir la misma turbidez que en el patrón 0,5 de la escala de McFarland.
3. Con la micropipeta, tomamos 100μl de la muestra y la depositamos en el centro de la placa de petri.
4. Cogemos el asa de digalsky y la sumergimos en un vaso de precipitado con etanol. Esterilizamos con el mechero.
5. Extendemos con el asa la muestra por la placa. Volvemos a sumergir el asa en etanol y esterilizamos.
6. A continuación cogemos las pinzas y repetimos el mismo proceso para esterilizar que con el asa.
7. Cogemos los discos de antibiótico y los depositamos en la placa.
8. Volvemos a esterilizar las pinzas.
9. Incubar en la estufa 24h y observar el resultado.
10. El resultado se obtiene midiendo el diámetro del halo.

7. Resultado.

• Muestra 5:

- Antibióticos presentes: Clindamicina (CD), Chloranphenicol (C), Cefazolín (CZ) y Neomycina (N).

- Diámetros obtenidos:

        + Clindamicina (CD): 30 mm

        + Chloranphenicol (C): 25 mm

        + Cefazolín (CZ): 0 mm

        + Neomycina (N): 15 mm

- Resultado:

        + Clindamicina (CD): Sensible

        + Chloranphenicol (C): Sensible

        + Cefazolín (CZ): Resistente

        + Neomycina (N): Sensibilidad intermedia

• Muestra 8:

- Antibióticos presentes: Chloranphenicol (C), Cefazolín (CZ), Neomycina (N) y Penicilina (PG).

- Diámetros obtenidos:

        + Chloranphenicol (C): 23 mm

        + Cefazolín (CZ): 0 mm

        + Neomycina (N): 16 mm

        + Penicilina (PG): 0 mm

- Resultado:

        + Chloranphenicol (C): Sensible

        + Cefazolín (CZ): Resistente

        + Neomycina (N): Sensibilidad intermedia

        + Penicilina (PG): Resistente

ESCALA DE MCFARLAND

1. Objetivo.

En esta práctica prepararemos la Escala de McFarland, cuya utilidad es estimar la densidad bacteriana de una suspensión.

2. Fundamento.

Prepararemos la escala mezclando ácido sulfúrico al 1% con cloruro de bario al 1,175% en cantidades diferentes, dependiendo de a qué patrón corresponda.

3. Medidas de seguridad.

- Guantes.
- Bata.
- Cabina de bioseguridad.

4. Material.

- Tubos de ensayo.
- Matraz de 500ml y 50ml.
- Pipetas de cristal.
- Vaso de precipitado.
- Embudo.
- Agua destilada.
- Varilla de cristal.
- Vidrio de reloj.
- Báscula.

5. Reactivos y muestra.

- Ácido sulfúrico al 1%.
- Cloruro de bario al 1,175%.

6. Cálculos.

• Matraz 500ml con H2SO4 al 1%:

             V_o x C_o = V_F x C_F

              V_o x 98 = 500 x 1

           V_o = 5,102 ml de H₂SO₄ 

       500 - 5,102 = 494,897 ml de agua destilada

• Matraz 50ml con BaCl2 al 1,175%:

            V_o x C_o = V_F x C_F

         V_o x 100 = 50 x 1,175

         V_o = 0,587 ml de BaCl2

        50 - 0,587 = 49,4 ml de agua destilada

• Llenado de tubos:

Patrón	H2SO4 al 1%	BaCl2 al 1,175%
0,5	= 24,875 ml	25 ml – 24,875 = 0,125 ml
1	= 24,75 ml	25 ml – 24,75 = 0,25 ml
2	= 24,5 ml	25 ml – 24,5 = 0,5 ml
3	= 24,25 ml	25 ml – 24,25 = 0,75 ml
4	= 24 ml	25 ml – 24 = 1 ml
5	= 23,75 ml	25 ml – 23,75 = 1,25 ml
6	= 23,5 ml	25 ml – 23,5 = 1,5 ml
7	= 23,25 ml	25 ml – 23,25 = 1,75 ml
8	= 23 ml	25 ml – 23 = 2 ml
9	= 22,75 ml	25 ml – 22,75 = 2,25 ml
10	= 22,5 ml	25 ml – 22,5 = 2,5 ml

7. Protocolo.

• Matraz de H2SO4:

1. Encendemos la cabina.
2. Echamos un poco de H2SO4 en un vaso de precipitado y agua destilada en otro vaso.
3. Tomamos con la pipeta de cristal de 5,10 ml de H2SO4 y lo añadimos al vaso de precipitado que contiene agua destilada.
4. Removemos con la varilla de cristal y añadimos, posteriormente, al matraz con la ayuda de un embudo.
5. Terminamos de enrasar con agua destilada.

• Matraz de BaCl2:

1. Pesamos 0,587 gr de BaCl2 en la báscula.
2. Añadimos un poco de agua destilada en el matraz de 50 ml.
3. Añadimos el BaCl2 en el matraz con ayuda de agua destilada.
4. Terminamos de enrasar con agua destilada y homogeneizamos.

• Llenado de tubos:

1. Cogeremos 11 tubos de ensayo.
2. Llenamos cada tubo con 25 ml (total de ambas cantidades de H2SO4 y BaCl2).

8. Resultado.